Ako mikroskopovať huby

Miloslav Procházka

Časť 1.

Pri hlbšom zaujme o mykológiu sa skôr čí neskôr vynorí potreba huby mikroskopovat. Otvára sa tak aspoň sčasti fascinujúci mikroskopický svet veľkého množstva nových tvarov a štruktúr, ktorý okrem svojej estetickej stránky ukazuje aj účelnosť a dokonalosť spojenia tva­ru a funkcie v prírode. Moderná systematika je založená prevažne na mikroznakoch a nedá sa bez ich znalostí plne pochopiť. Aj keď je rad rodov aj druhov, kde sa zaobídeme pri určo­vaní bez mikroskopu, je veľa takých, kde to vôbec nie je možné, alebo určenie je iba približ­né a nespoľahlivé. Nie je cieľom týchto riadkov podať 'vyčerpávajúci návod alebo prehľad, skôr Ide o stručný úvod, komentované odkazy na základnú literatúru a niektoré poznámky, uľahčujúca prvé kroky v tejto oblasti. Pre začiatočníka je ideálna spolupráca so skúsenejším kolegom.

Mikroskop: Nestačí lacný, jednoduchý, "školský", pretože treba veľké zväčšenie a dobrú rozlišovaciu schopnosť, ak chceme pozorovať drobné a jemné štruktúry (napr. ornamentiku výtrusov). Obraz vytvára objektív a predovšetkým od neho závisí kvalita. Okulár iba zväčšuje obraz vytvorený objektívom. Postačujú úplne 3 objektívy a to pre malé zväčšenie (6 až 10x), ďalej stredne silný (40 až 45x) a bezpodmienečne aj imerzný (100x). Pre menšie riziko po­škodenia je výhodnejšie ak silnejšia objektívy sú pérové, a sú pre ne vhodnejšie ortoskopické alebo periplanatické okuláre (označované napr. ako O alebo P vo firme Meopta) než Huygensove okuláre (H), pretože majú väčšie zorné pole a sú lepšie opticky korigované, Celko­vé zväčšenie mikroskopu je lineárne a je násobkom zväčšenia objektivu a okulára. Znamená to, že úsečku pri celkovom zväčšení 1000x vidíme skutočne 1000x dlhšiu, napr. 2 µm ako 2 mm. Podstatnejšie je ale tzv. užitočné zväčšenie. Každý objektív má určitú maximálnu rozli­šovaciu schopnosť, čo znamená, aké najmenšie štruktúry je ešte schopný rozlíšiť. Túto schopnosť objektívu vyjadruje tzv. numerická apertura, ktorá býva vyznačená na objektíve. Maximálne užitočné zväčšenie je asi 1000 násobkom numerickej apertúry, najviac teda 1250x až 1300x a umožňuje rozlíšiť štruktúry až asi do 0,2 µm. Ak by sme celkové zväčše­nie zvýšili nad túto hranicu použitím silnejšieho okuláru, neziska sa tým možnosť rozlíšiť viac detailov, ide o tzv. prázdne zväčšenie a je treba v každom prípade uvážiť jeho význam, Využitie apertúry nad 1 pri imerzných objektívoch je podmienené použitím imerzie. Imerziu sl môžeme sami ľahko pripraviť podľa Josseranda (1). Zmiešame 5 dielov čerstvého ricíno­vého oleja a 7 dielov klinčekovej (hrebíčkovej) esencia (oleja). Okrem toho, že si ju môžeme pripraviť sami je výhodná tým, že má malú viskozitu a preto sa pri pohybe krížového stolíka menej pohybuje aj krycie sklíčko a tým aj pozorovaný predmet, najmä spóry; ďalej menej za­sychá a ak častejšie mikroskopujeme stačí objektív iba utrieť, ale netreba ho čistiť.

K čisteniu objektívu sa nesmie použit benzín. Vhodný je xylol, ktorým Iba trocha navlhči­me čisté vypratú jemnú handričku a otrieme opatrne čelnú šošovku objektívu. Xylolu nesmie byť veľa a nesmie sa s nim objektív zaplaviť, inak sa môže poškodiť. Zabúda sa, že pokisf sa nekvapns imerzný olej medzi kondenzor a podložné sklíčko (tzv. kondenzorová imerzia) nevyužijeme plne rozlišovaciu schopnosť imerzného objektívu (je to ako keby sme mali su­chý objektív). Robíme to zriedkavo vtedy, ak chceme pozorovať najmenšie detaily, Podlož­né sklíčko musí byť tenké, špeciálne vyrobené. Krycie sklíčka sú podľa hrúbky rozlíšené na 0 (najtenšie), 1 a 2 (najhrubšie). Najvhodnejšie sú číslo 1 s hrúbkou 0,16 až 0,18 mm. S číslom 0 sa ľahko lámu, číslo 2 zhoršujú kvalitu obrazu silných objektívov a je riziko poško­denia čelnej šošovky imerzného objektívu. Imerzný objektív musí byť veľmi blízko pozorova­ného predmetu (tzv. pracovná vzdialenosť) a ak je krycie sklíčko hrubé a trocha hrubší je aj preparát, nedokážeme sa priblížiť do správnej pracovnej vzdialenosti, nezaostríme a prípad­ne môžeme aj poškodiť objektív. Dobré a správne nastavené osvetlenie a kvalitný konden­zor s dostatočnou aperturou, sú predpokladom využitia rozlišovacej schopnosti silných ob­jektívov a naopak sú častou príčinou zlého obrazu. Tak Isto aj krížový stolík alebo krížový vodič preparátov pripevnený na obyčajný pevný stolík je nevyhnutnou požiadavkou pre jem­ný pohyb pozorovaného predmetu. Binokulárny mikroskop jo výhodnejší, menej unaví oči, ale treba vedieť s nim pracovať, monokulárny taktiež plno postačuje.

Nový mikroskop je drahý prístroj, špičkové firmy ako napr. Nikon a Olympus dodávajú kvalitné prístroje jednoduchšie laboratórne, nie tzv. veľké bádateľské mikroskopy) asi za 80 000 a2 100 000 Sk. Pokračovateľom výroby bývalej československej firmy Meopta je t.č. pražská firma Lambda, ktorá predáva dostatočne kvalitné mikroskopy modernej konštrukcie asi za 30 000 až 35 000 Kč. Jediná schodná cesta pre väčšinu záujemcov je pokúsiť sa kú­piť starší, ale ešte funkčný prístroj. Treba ho ale vyskúšať a bezpodmienečne kupovať s od­borníkom. S najväčšou pravdepodobnosťov to bude značka Meopta.

Nestačí preparát iba pozrieť, videné je treba aj nakresliť a zamerať. V našom prípade sa merajú dĺžkové charakteris­tiky pozorovaných Štruktúr. Potrebujeme k tomu objektívový mikrometer. Je to vlastne podložné sklíčko, na ktorom je v kruhu nalepená doštička so stupnicou a to 1 mm rozdelený na 100 dielikov. Ďalej je treba okulárový mikrome­ter (obr.1a). Je to sklená kruhová doštička s vyrytou stupni­cou (väčšinou 1 cm delený na 100 dielikov), ktorú vložíme do okuláru na clonku a to stupnicou dolu, alebo je už zabu­dovaná v špeciálnych okulároch (tieto majú ešte možnosť presne zaostriť stupnicu). Ociachujeme zaostrením na ob­jektívový mikrometer a spočítame (pokiaľ možno čo na najdlhšlom úseku) koľko dielikov okulárového mikrometru pri­padá na určitý počet dielikov objektívového mikrometra (me­ranie niekoľkokrát opakujeme). Vieme 2e 1 dielik objektívového mikrometra sa rovná 10).im. Z nameraných hodnôt potom vypočítame, akú absolútnu hodnotu v mikro­metroch (jom) má 1 dielik okulárového mikrometra pre danú kombináciu objektlv-okulár. Výsledok použijeme ako prepočítavací faktor, ale výhodnejšie je zostaviť si vhodnú tabuľ­ku. Keď napríklad 10 dielikov objektívového mikrometra sa rovná 40 dielikom okulárového, znamená to, 2e 1 dielik okulárovej stupnice sa rovná 2,5(.im. Táto hodnota je trvalá kým sa nezmení optický systém, t.j. okulár, objektív a dĺžka tubu­su). Nevýhodou je, že sa merané štruktúry väčšinou nekry­jú s ryskami okulárového mikrometra a príslušné zlomky tre­ba odhadovať. Namerané hodnoty príslušne zaokrúhľujeme (nad 20µm na 0,5µm, nad 30µm na 1µm a nad 100µm na 5 až 10 µm). Pozorované zakresľujeme. Je to dokumentácia a protokol, ale učíme sa tým aj pozorovať a rozumieť mikros­kopovanému objektu. Kresba je do určitej miery schéma, predpokladá pochopiť čo vidíme, vybrať typickú štruktúru a charakteristické znaky a potlačiť nadbytočné, nepodstatné a často rušivé detaily. Veľmi častou chybou je príliš malá kres­ba, kde sa potom už nedá všetko "vtesnať", a nie je možné zachovať pomery a proporcie.

Treba kresliť pokiaľ možno veľké obrázky. Je nutné si uvedomiť, že mikroskopické zväč­šenie a zväčšenie pri kresbe je rozdielne. Napr. pri výtrusoch odporúča Josserand (1) kresliť v pomere 1:4 000 a opisuje aj praktickú metódu.

Je veľa knih o mikroskopii. Odporúčam výbornú knihu J. Pazourka, plne dostačujúcu pre naše účely: Pracujeme s mikroskopem (2).

Časť 2.

V tejto časti sa opisujú jednoduché spôsoby zhotovovania preparátov, ku ktorým netre­ba špeciálne zariadenia a to predovšetkým na pečiarkotvaré a hríbovité huby. Treba si uve­domiť, že sa mikroskopuje v prechádzajúcom svetle, to znamená, že lúče musia prejsť cez preparát. Je to možné iba vtedy, ak je preparát dostatočne tenký, čím tenší, tým lepšie. Okrem toho aj preto, že sa jednotlivé elementy a štruktúry neprekrývajú a dajú sa lepšie oddiferencovať. Máme dve možnosti ako to dosiahnuť: urobiť roztlačený preparát, alebo rezy z tkaniva.

1. Roztlačený preparát, sa používa vtedy, keď nezáleží na vzájomnom vzťahu jednotlivých elementov a detailoch mikroskopickej skladby tkaniva. Maličký kúštik huby sa dá na podlož­né sklíčko do vhodného média a prípadne sa rozdelí na menšie časti a upraví preparačnými ihlami a ostrou pinzetou. Priloží sa krycie sklíčko, na ktoré sa jemne zatlačí (napr. gumou na konci ceruzky alebo iným vhodným predmetom). Tkanivo sa tlakom čiastočne rozostúpi, rozruší sa jeho stavba a môžeme ho v tenkej vrstve pozorovať, ale môže sa tým čiastočne deformovať a jeho štruktúra sa ruší.

Rezy treba robiť čo najtenšie, ak sa skúma mikroskopická skladba . Všetky sa nepodaria, preto ich zhotovujeme vždy viac. Vyberáme z nich tie najlepšie, pričom aj tak iba časť rezu je vhodná na pozorovanie. Je možno použiť jednoduchý ručný mikrotom. Vyrábala ho kedy si napr. firma Meopta, existujú aj návody ako si ho zhotoviť (4). Reže sa v nich väčšinou časť huby uchytená do bazovej duše. Niekedy odporúčaný polystyrén veľmi rýchlo otupí žiletku. Pri dostatočnom cviku sa dajú urobiť vyhovujúce rezy aj ručne. Užívajú sa dve techniky. Pri prvej sa časť huby položí na podložku, pridrží sa ukazovákom ľavej ruky a pravou sa robia paralené rezy. Je jednoduchá, osobne ju používam. Pri druhej sa lakte opierajú o stôl, vhodný kúštik huby sa drží medzi palcom a ukazovákom ľavej ruky a pravou sa reže. Detailný opis týchto techník pozri (5). Na rezanie možno použiť britvu, výhodnejšie sú však žiletky, ktoré sa po otupení vyhodia. Žiletky používame jednoduché, oceľové (nie platinové), radšej silnejšie, pretože príliš tenké sa ohýbajú. Ďalšia užitočná a jednoduchá pomôcka, ktorá nahradí zložitejšie optické zariadenia a ktorá zlepšuje podstatne výsledky práce, sú okuliare, v ktorých sú spojky 3 až 4 dioptrie. Ak je niekto ďalekozraký, pridá k svojim okuliarom tieto dioptrie. Pri iných chybách okraje vhodné si sklá vopred vyskúšať. Vhodné rezy prenášame na podložné sklíčko vlhkým štetčekom alebo preparačnou ihlou. Veľmi drobné huby sa dajú rezať týmto spôsobom len ťažko. Odporúča sa jednoduchá metóda (3). Treba si k nej zadovážiť špeciálne upravený polyetylénglykol, ktorý sa užíva v histológii a je roz­pustný s vodou. Má viac továrnych značiek, napr. Carbowax, Histowachs, aj keď nejde o pravý vosk. Kúštik s veľkosťou malého hrášku sa na podložnom sklíčku zahrieva zapaľo­vačom, kým sa neroztopí (vhodný druh s bodom topenia 50-55 °C) a tesne pred opätov­ným ztuhnutím sa do neho vloží vhodným smerom orientovaná huba, ktorá sa tak fixuje a dá sa dobre rezať. Rezy treba vymyť vodou od zvyškov vosku, v ktorom boli zafixované. Je veľmi dôležité vybrať si na plodnici vhodné miesto na mikroskopické vyšetrenie a správne orientovať rez. Z pokožky klobúka môžeme stiahnuť kúštik pokožky, očistiť ho od prípadných zvyškov dužiny a položiť na podložné sklíčko povrchom nahor. Často to stačí, ale niekedy treba k detailnejšiemu štúdiu štruktúry robiť radiálne rezy, to znamená orientované v smere osy stred klobúka - okraj. Volíme stred tejto spojnice, občas je však treba vyšetriť aj pokožku v strede klobúka. Často je výhodnejšie mať čerstvý materiál, z exsikátu sa to niekedy dá len ťažko, plodnice by nemali byť príliš staré. Lupene režeme väčšinou kolmo na pozdĺžnu os, vždy sa musí zachytiť aj ostrie. Vyberáme si ich stred a nie okraje. Niekedy je užitočné uro­biť rez na ostrie, keď paralelne s pozdĺžnou osou odrežeme čo najtenší, asi milimetrový okraj lupeňov, teda "ostrie". Má to význam, keď je málo cheilocystíd a na malej ploche transverzálneho rezu by sme ich nemuseli nájsť, alebo vtedy keď málo vyčnievajú a sú ťaž­ko odlíšiteľné od susedných buniek. Vtedy po prezretí preparátu je možné sa pokúsiť ich uvoľniť z kontextu tkaniva jemným poklopkaním alebo tlakom na krycie sklíčko. Ak chceme dokázať prítomnosť kaulocystíd, stiahneme pozdĺž hlúbika žiletkou čo najtenší pásik a po­zorujeme ich. Treba často vyšetriť tak hornú, ako aj dolnú časť hlúbika. Často sa dá ich prí­tomnosť dokázať siínejšiou lupou. Výtrusy pokiaľ možno pozorujeme z výtrusného prachu, pretože v ňom sú zrelé. Ak ho nemáme, pokúsime sa ich zotrieť jemným vlhkým štetčekom alebo zoškrabať žiletkou z povrchu hlúbika. Ak sa to nepodarí, pokúsime sa ich zotrieť z plochy lupeňov štetcom, alebo ich pozorujeme pri vyšetrovaní lupeňov. Posledné dva spôsoby majú to riziko, že spóry môžu byť nezrelé a tým sa môže niekedy značne zmeniť ich morfo­lógia, veľkosť a heterogenita. Dokazovať prítomnosť alebo chýbanie praciek býva často ťaž­ké. Výhodné je predovšetkým exsikáty macerovat' najskôr asi hodinu až dve v 10% KOH. Potom sa malý fragment huby dilaceruje a urobí roztláčaný preparát, ale treba pracovať še­trne, pretože hýfy sa s obľubou trhajú práve v mieste praciek. Potom ich zafarbíme napr. kongo-červeňou. Rezy môžeme robiť z čerstvého materiálu alebo z exsikátov. V obidvoch prípadoch záleží na konzistencii. Ak je huba napr. príliš nasiaknutá vodou, mäkká a mazľa vá nedá sa urobiť dobrý rez. Naopak, keď je priveľmi suchá alebo ide o exsikát, drobí sa a láme pri rezaní a treba ju rehydratovať tak, aby sa stala ohybná, vláčná a dala sa rezať. Exsikáty, buď celé alebo častejšie iba ich časti, môžeme k tomu účelu dať do Petriho mis­ky, do ktorej vložíme trocha navlhčenej vaty a potom ju zakryjeme. Kühner a Romagnesi od­porúčajú použiť trocha vlhkého machu alebo čerstvú šupku z pomaranča. Nie je vhodné dať hubu priamo do vody, lebo sa často príliš rozmočí a zle sa reže. Rýchlejšie sa to dá urobiť tak, že vzorku z ktorej budeme robiť rezy ponoríme aspoň na pol minúty do koncentrované­ho alkoholu, do ktorého sme pridali minimum vody a potom ju prenesieme na chvíľu do vo­dy, až nadobudne správnu konzistenciu. Potom robíme rezy rovnakým spôsobom ako pri čerstvej plodnici. Takto urobené rezy treba ešte úplne rehydratovať, "napučať". Robí sa to tým, že ich prenesieme do kvapky 5% amoniaku (používajú sa koncentrácie 5-10 %), resp. do 3-5 % KOH. Čpavok je šetrnejší. Niektorí autori (3) odporúčajú rezy v kapke KOH alebo čpavku na podložnom sklíčku zohriať plameňom zapaľovača, až začnú vystupovať pary, čo proces podstatne urýchli. Potom sa tekutina odsaje filtračným papierom a po pridaní vhod­ného farbiva môžeme mikroskopovat'. S úspechom som vyskúšal návod podlá Clemensona (6). Použije sa roztok s týmto zložením: 20ml koncentrovaného amoniaku, 1 g glycerínu a 80 ml 96% etanolu. Po aplikácii toho roztoku sa rezy veľmi dobre zhotovujú. Potom sa pre­nesú do 3% čpavku, aby napučali. Niektoré farbivá, ktoré obsahujú napríklad čpavok alebo laktofenol, dokážu rezy plne rehydratovať a napučať aj bez predchádzajúceho použitia KOH alebo čpavku.

Časť 3.

• tejto poslednej časti sa hovorí o základných chemických reagenciách a farbivách po­užívaných pri mikroskopickom vyšetrení. Používame ich preto, aby vynikli určité štruktúry, alebo aby sme ich od seba odlíšili, poprípade sa využívajú mikrochemické reakcie s určitý­mi celulárnymi substanciami, ktorých výsledkom je špecifická farebná reakcia (napr. amyloidná s Melzerovým činidlom). Ich obrovský význam netreba zdôrazňovať. Neexistuje univer­zálne reagens, vyberáme si vždy ten roztok, ktorý najlepšie vyhovuje cieľom konkrétneho vyšetrenia, často treba použiť viac spôsobov farbenia. Preto treba poznať ich základné vlastnosti. Ako nešpecifické médium sa používa obyčajná voda, napr. vtedy, ak chceme po­znať prirodzenú farbu vyšetrovanej štruktúry, ako sú výtrusy. Má aj tú výhodu, že na rozdiel od niektorých roztokov (napr.KOH, čpavok alebo alkohol) nerozpúšťa pigmenty, niektoré in­krustácie alebo tukové kvapôčky. Medzi vodou a vnútrom buniek býva značný osmotický gradient. Voda je hypoosmolárna a preto môže prenikať do vnútra do tej miery, že napr. vý­trusy môžu zväčšiť veľkosť a deformovať svoj tvar. Aby sa tomu zabránilo, možno použiť napr. fyziologický roztok (0,9% roztok NaCI v H2O). Niekedy sa používajú naopak hyper- osmolárne roztoky, ako je napr. asi 10% roztok cukru (podľa výsledku sa dá koncentrácia upravit), ktoré vedú k scvrknutiu bunkového obsahu, zmenšeniu vakuol a pomáhajú určiť, kde je lokalizovaný pigment (vakuoíárne, v stene bunky). Dá sa pozorovať aj v roztoku L4 podľa Clemencona a iných nefarebných médiách. L4 je vhodný tak pre exsikáty, ako aj pre čerstvé huby. Okrem toho sa doňho pridávajú niektoré farbivá a slúži tak ako základný roz­tok na prípravu farbív. Pripraví sa zmiešaním nasledujúcich položiek v poradí, ako sú uve­dené: 80ml H2O, 0,8g pevného KOH, 0,8g NaCI, 0,5g koncentrovaného Invadinu, 0,5g fe­nolu a 20g čistého glycerínu. Glycerín zabraňuje rýchlemu odparovaniu vody, vysychaniu preparátu a znižuje rušivé pohyby výtrusov v zornom poli. Invadin firmy Sandoz je vlastne detergentná látka toho typu, aký sa používa v prípravkoch na umývanie riadu (napr. Pur, Jar) a zabraňuje predovšetkým tvorbe bubliniek v preparáte.

• ďalšom uvediem iba základné a najčastejšie používané farbivá a roztoky. Okrem špe­ciálnych vyšetrení sa s dá s nimi skoro bez výnimky vystačiť. Niektoré špeciálne metódy bývajú opísané aj v monografiách o jednotlivých rodoch alebo skupinách húb. Melzerovo činidlo. Obsahuje 1,5g jodidu draselného, 0,5g jódu, 20ml destilovanej vody, ku ktorej sa nakoniec pridá 20 g chĺoralhydrátu.Treba ho uchovávať v tmavých flaštičkách. Jód farbí, chloralhydrát preparát prejasní a napučí. Jód prítomný v roztoku nestráca svoje vlast­nosti, ale chloralhydrát sa časom mení. Niektorí ho preto odporúčajú pridať do roztoku jodidu draselného a jódu, pripravenému do zásoby vo väčšom množstve, až tesne pred po­užitím. Nie je to však nutné, lebo činidlo spoľahlivo vydrží niekoľko mesiacov a stačí ho znovu pripraviť až po tejto dobe. Pre určité špeciálne prípady a niekedy pre staršie herfcc. rové položky odporúča Z.Pouzar roztok s trojnásobným množstvom jódu. Melzerov roztok dáva buď nešpecifické zafarbenie, respektíve žiadne, alebo môže dôjsť k jednej z dvoch dôležitých farebných reakcií:

1.AMYLOIDNÁ REAKCIA. V tomto prípade sa daná štruktúra zafarbí jódom na modro alebo modrofialovo podobne ako škrob (lat.amylum). Niekedy je re­akcia veľmi výrazná, skoro modročierna, inokedy slabá, nevýrazne sivomodrá s radom možných prechodov. Časo sa sfarbí takto iba časť bunky, napríklad amyloidná ornamentika výtrusov v rodoch Lactarius, Russula, Melanoleuca a iných. V niektorých rodoch, ako je napr. Amanita, môžu mať niektoré druhy amyloidné výtrusy (celé), iné druhy zasa neamylo- idné. Občas sa zafarbia aj iné elementy, napr. hýfy na báze hlúbika v rode Chroogomphus na rozdiel od rodu Gomphidius, kde sa nefarbia. Pri niektorých diskomycétoch je dôležitým znakom prítomnosť alebo chýbanie modrého zafarbenia vrcholu (hrotu) vrecka, prípadne sa na modro zafarbí amyloidný pórus na vrchole inoperkulátneho vrecka.

2.DEXTRÍNOIDNÁ, (PSEUDOAMYLOIDNÁ) REAKCIA. Rozumie sa tým hnedočervené, červenohnedé alebo až skoro purpurové zafarbenie po aplikácii tohto činidla. Môžu sa tak zafarbiť hýfy, výtrusy alebo aj iné útvary. Toto činidlo, pomenované po svojom objaviteľovi, českom mykológovi V.Melzerovi, je vari najčastejšie používané činidlo v mykológii a je veľmi dôležité tak pre systematiku, ako aj pre určovanie húb.

Kongočerveň. Môže sa použiť 1% vodný roztok. Výhodnejší a častejšie používaný je 1% roztok v čpavku. Roztok musí byť číry, prípadný nadbytok farbiva sa odstráni filtráciou. Vy­drží aj niekoľko rokov, ak je dobre uzavretý. Zanecháva ťažko odstrániteľné škvrny. Má ši­roké použitie pri vyšetrení pokožky klobúka, rôznych typov cystíd, ale aj hýf s ich septami a prackami. Farbí predovšetkým bunkové steny. Často ostáva v preparáte prebytok farbiva, ktorý pôsobí rušivo pri pozorovaní. Je výhodné a platí to aj pre iné farbivá, preparát upraviť tak, že sa k okraju krycieho sklíčka pridá trocha 3 až 5% KOH alebo 3 až 10% čpavku a z druhej strany krycieho sklíčka sa odsáva. Tým vniká čpavok alebo KOH pod krycie sklíčko a nahradí farbivo. Kvalita preparátu sa takto podstatne zlepší.

Bavlníková modrá. Pripraví sa rozpustením 0,05g farbiva v 30ml kyseliny mliečnej. Dá sa použiť áj vo forme vodného roztoku alebo rozpustená v laktofenole. Ak sa stena výtrusu farbí zreteľne na modro, pričom jeho vnútorná časť sa buď nezafarbí alebo iba podstatne menej, volá sa cyanofilná, ak to tak nie je, označuje sa ako acyanofilná. Tieto rozdiely medzi stenou výtrusu a jej vnútornou časťou sú dobre viditeľné na výtrusoch rodu Amanita, ktoré sú acyanofilné a majú v tomto činidle nezafarbenú stenu, ale zreteľne modrú proto­plazma Zahriatie preparátu na niekoľko sekúnd podstatne urýchli reakciu. Niekedy sa za­farbí a znázorní iba ornamentika, napr. v rode Ramaria. Používa sa aj pri štúdiu ornamenti­ky výtrusov vreckatých húb. Má svoje miesto aj pri zisťovaní niektorých druhov hýf (napr. generatívnych).

Krezylová modrá. Používa sa vodný roztok, ktorý sa dá pripraviť ad hoc tak, že do 1-2 kvapiek vody na podložnom sklíčku sa dá veľmi malé množstvo farbiva a rozmieša sa na farbu tmavého, ale číreho atramentu. Trvanlivejšie je činidlo podľa návodu Clemencona (3). Je to 0,3% roztok v zmesi glycerínu, etanolu a destilovanej vody. Zisťuje sa tak metachro- mázia. Označuje sa tým jav, keď stena výtrusu alebo jej časť sa farbí rozdielne od farby po­užitého farbiva, v tomto prípade teda nie na modro, ale purpurovo alebo purpurovočerveno. Je to tak napr. v rodoch Leucocoprinus, Leucoagaricus, Macrolepiota. Metachromaticky môžu reagovať aj iné štruktúry než výtrusy, napr. hýfy niektorých druhov rodu Mycena.

Uvedené farbivá stačia na veľkú väčšinu práce neprofesionálneho mykológa. Existuje celý rad farbív a špeciálnych techník, ktoré sú obmedzené iba na niektoré skupiny húb, ale­bo na špeciálne prípady. Nebudú tu podrobnejšie opísané, odkazujem na literatúru, zmie­nim sa stručne iba o niektorých. Patrí sem farbenie acetokarmínom, používané pri dô­kaze karminofilných granulácií v bazídiách rodov Lyophyllum, Tephrocybe a Calocybe. Far­benie Sudanom znázorňuje selektívne tukovité látky. Pri hlbšom štúdiu plávok sa používa bázický fuchsín (ako karbolfuchsín ktorý umožňuje sooľahlivo zistiť tzv. primordiálne hvfv v pokožke klobúka. V tom istom rode sa pouzivaju cimaia založene na baze suitaidehyaov, ktorými sa dá dokázať prítomnosť alebo chýbanie dermatocystíd v pokožke klobúka. Je to sulfovanilín, sulfobenzaledhyd a sulfopiperonal. Americkí mykológovia uprednostňujú pred kongočerveňou floxín (phloxin) B, ktorý farbí na červeno prevažne cytoplazmu.

Niektoré roztoky, ktoré sa ťažko pripravujú, je výhodejšie získať z laboratória, kde sú pripravované na spoľahlivej úrovni (napr.acetokarmín). Záleží aj na kvalite a značke použi­tého farbiva. Niektoré farebné reakcie a vyšetrenia sa ťažko dajú robiť na exsikátoch, resp. sú nespoľahlivé, v niektorých prípadoch však môže byť použitie exsikátu dokonca výhod­nejšie. Niektoré vyšetrenia je lepšie robiť na mladých plodniciach, napr. zisťovanie karmi­nofilných granulácií. Ako v iných oblastiach, aj tu treba získať skúsenosti a používať vlas­tnou praxou overené postupy. Na to je potrebná aj literatúra, preto by som chcel na záver trocha bližšie komentovať citované monografiické pramene.

Práca Igora Fábryho Metodika štúdia vyšších húb je bohužiaľ ťažko dostupná. Vyšla iba v malom náklade pre vnútornú potrebu bratislavských škôl v Pedagogickom ústave mesta Bratislavy. Je cyklostylovaná s perokresbovou prílohou od A.Dermeka. Opiera sa koncepciou o prácu M.Josseranda. Je pomerne podrobná, obsahuje aj pokyny na zber húb, metódy makroskopického opisu a všíma si aj organoíeptické vlastnosti. Podrobne sú opísa­né okrem mikroskopických aj makroskopické znaky a metodika mikroskopického vyšetre­nia. Všetko je podložené bohatými skúsenosťami autora. Prihliada na zvláštnosti jednotli­vých skupín húb. Na konci je veľmi stručný prehľad systému húb. Je to klasická, stále aktu­álna a pre väčšinu amatérskych mykológov postačujúca príručka. Je priekopnícka aj pre o slovenskú terminológiu.

Josserandova veľmi podrobná, niekedy trocha rozvláčna kniha La déscription des champignons supérieurs má podobný obsah ako predchádzajúca, neobsahuje však pre­hľad systému húb a zaoberá sa v podstate iba hríbotvarými Boletales a lupeňotvarými Aga- rícales. Je to v tejto oblasti klasické dielo francúzskej mykológie. Prvá časť (Technique dés- criptive) sa zaoberá technikou, metódami makroskopického a mikroskopického vyšetrenia a opisu ako aj s vysvetlením príslušných pojmov. V druhej časti (Vocabulaire raisonné du Déscripteur), ktorá dopĺňa prvú, sú vo forme výkladového slovníka uvedené a vysvetlené príslušné pojmy. Obsahuje rad cenných poznatkov, ktoré autor čerpal za dlhé roky práce v mykológii a ktoré by sme ťažko hľadali inde. Je aj vynikajúcou príručkou na poznanie fran­cúzskej terminológie.

Kniha nemeckých autorov Erba a Matheisa - Pilzmikroskopie sa zaoberá výlučne mik- roskopiou húb, a to v celej oblasti makromycétov. Prednosťou knihy je 135 vynikajúcich fa­rebných mikrofotografií z preparátov zhotovených jednoduchými metódami. Je stručná, jas­ná, inštruktívna a je dobrá aj na oboznámenie sa s nemeckou terminológiou. Je koncipova­ná predovšetkým ako pomôcka pre amatérských mykológov začínajúcich sa zaoberať mik­roskopováním húb.

Dielo anglosaských autorov Largenta a Johnsona z USA a Watlinga z Anglicka má rov­naký obsah ako predchádzajúce. Je to tretí zo štvordielnej série kníh, ktoré majú za cieľ po­môcť určiť huby až na úroveň rodu. Je dobre ilustrovaný čiernobielymi mikrofotografiami a perokresbami, je však "odbornejší" a pre samostatný vstup do mikroskopie húb dosť nároč­ný. Tak ako predchádzajúce diela dáva možnosť zoznámiť sa s terminológiou, v tomto prí­pade anglickou.

Pazourkova veľmi dobrá kniha - Pracujeme s mikroskopom je venovaná všeobecnej mikroskopii, je písaná prístupne a prakticky a je určená predovšetkým začiatočníkom. Plne postačuje pre potreby amatérského mykológa. Výhodou je, že sú opísané aj mikroskopy f. Meopta.

Postrehy:
Výtrusy jsem doposud získával výhradně tak, že jsem posadil plodnice výtrusorodou vrstvou na podložní sklíčko, přiklopil skleničkou a počkal do rána. Výhodou je, že se sklíčko s výtrusným prachem dá přenést

na libovolný podklad a lépe tak odpozorovat jeho barvu. Na podložní sklíčko se mi vejdou s rezervou tři krycí sklíčka a tak si obvykle nanesu kapku Melzerova činidla, kapku kongočerveni a kapku bavlníkové modři v laktofenolu. Říkám tomu semafor. Někdy použiji místo kongočerveni vodu a nebo na doporučení Mata dětský šampón. Přiklopím opatrně krycí sklíčka jemně přitlačím a jdu mikroskopovat.
Dávkování kapiček
Všelijaké kapátka, co jsem potkal mi dělají moc velké kapky a je pak potřeba odsávat čímž se obvykle ztratí i mnoho výtrusů. Jako dokonalé mi přijdou malinké stříkačky (1 mL, tzv. tuberkulinky) s tenoučkou jehlou. Tím se dá perfektě nadávkovat (při troše zkušeností) přesně tolik, kolik je potřeba.
Přimáčknutí sklíčka
Sklíčko je potřeba nepřitlačovat silou velkou neboť se ty výtrusy dají vcelku snadno rozmačkat. To jsem zpočátku fakt netušil a mnoho vzorků jsem musel dělat znovu Někde jsem viděl, že používají k přitlačení sklíčka obyčejnou tužku s gumou na konci - tedy tou gumou. Zkoušel jsem to, jde to vcelku fajn. Když se to přežene s množstvím média, je vhodné ho zároveň při tlačení na sklíčko odsávat pojákem či nějakým filtračním papírem či buničinou či papírový kapesníkem či tak něco.
Melzerovo činidlo
Dává odpověď o amyloiditě výtrusů a je tedy nezbytné neboť tím lze pokročit při určování. V případě amylodiní reakce zvýrazní ornamentiku natolik, že ji lze parádné vidět (holubinky, ryzce). Pokud je reakce jiná, pak je ornamentika obvykle jen obtížně pozorovatelná. Dobré je také v tom, že jsou v něm výtrusy poměrně méně pohyblivé a dají se tedy lépe fotit. Nejlepší je, když kolem sklíčka trochu činidla "vyčnívá" (jen tak jakože vlhko). Po několika minutách zaschne a pohyb výtrusů někdy téměř zamrzne a to je pak pohoda fotit. V Melzerovy obvykle nelze pozorovat septa, a tukové kapky jsou vidět taky jen obtížně. Ani případný fázový kontrast toho moc neodhalí.
Kongočerveň - Congo Red
Velmi dobře se v něm pozorují tukové kapky. Septa obvykle vidět nejsou. Často vidím, že některé výtrusy se barví a jiné nikoli. Typuji, že je to dané stářím výtrusů (obvykle mi přišlo, že starší se nebarví a mladší ano. Jindy jsem viděl, že v barevných výtrusech běhají nějaké bakterie, zatímco v nebarevných nikoli. Zatím používám 1% vodný roztok, ale mám v plánu použít klasiku, tj. v roztoku hydroxidu (louhu) nebo amoniaku. Prý to zabraňuje srážení kongočerveně z roztoku (zatím jsem si toho nevšiml) a prý též projasňuje obraz.
Voda
Dobrá na odhad barvy výtrusů jako takových - nezaměňovat s barvou výtrusného prachu. Obraz je ve vodě obvykle mlhavý - možná bych měl používat destilovanou vodu.
Šampón - dětský hustý
Doporučuje Mat60 (ten má tuším favorita v kopřivovém ). Podobné vodě, ale obraz je obvykle čistší. Zmrazení pohybu jsem však obvykle bohužel nezaznamenal.
Bavlníková modř v laktofenolu - Lactophenol Cotton Blue
Přijde mi nezbytný neb pouze v něm jsou obvykle perfektně vidět případná septa. Jinak platí to co u Melzera - když okraje trochu zaschnou, tak se výtrusy téměř přestanou hýbat.
Pohyb výtrusů
Pro focení je to noční můrou, ale pro pozorování je to super. Když se navíc podaří, že výtrusy putují z jedné strany na druhou a "válejí přitom sudy", tak si člověk krásně prohléne jak přesně vypadají a jaký mají tvar. U statických je to občas hádankou.

Problém, který mne zatím nejvíce trápí je, jak získat výtrusný prach u malých plodnic, které rychleji zasychají nežli práší výtrusy.

Vymáchá se pár plodniček v kapičce vody či vodné kongočervěně a podobně, no a kapalina se pak nanesena sklíčko a udělá se roztěr. Funguje to vcelku dobře.
To se mi povedlo včera. Vezmul jsem plodničku chlupáčka (2 mm průměr) a položil výtrusným rouškem na kapku vody na podložním sklíčku. Za několik desítek? minut se voda odpařila. Plodničku jsem odstranil a na místo kde byl jsem kápnul bavlníkovou modř v laktofenolu a přeložil krycím sklíčkem. Výsledek mne velmi mile překvapil. Nejen, že tam bylo značné množství výtrusů, ale též mnoho parafýz a vřecek. Tohle budu rozhodně zkoušet častěji.

Do nějaké misky vložím vrstvu buničiny a nasytím ji vodou. Na vlhkou buničinu položím podložní sklíčka a na něj klobouček houbičky. Přiklopím skleněným (není asi nutné sklo) poklopem abych minimalizoval vysychání a čekám. Ráno tam asi bude. Může se stát, že pod kloboučkem houby se vytvoří kapičky vody ... po vyndání z vlhka velmi rychle uschnou a lze tak pozorovat i barevné změny výtrusného prachu v závislosti na vysychání. Velmi se mi (z jiných pokusů) osvědčilo, že pokud čekám na výstrusy z něčeho malého, tak je dobrá si nějakou fixou označit, kde houba ležela. Pokud je totiž výtrusný prach bezbarvý nebo je ho málo, pokud hrajete s výtrusy na schovávanou, pak počítejte s tím, že budete velmi často prohrávat

Rady od J. Červenku

Aký mikroskop na výtrusy ?

Na výtrusy treba mikroskop so zväčšením 1000x, treba však k tomu dokúpiť okulár s mikrometrickou stupnicou, pretože pri určovaní výtrusov je meranie veľmi dôležité. Tých 1000x z toho dôvodu, že tam je to meranie oveľa presnejšie ako napríklad pri 400x. Ak sa kombinuje napríklad okulár 20x s objektívom 50x, netreba žiadny olej, pretože 50-ka objektív je ešte dosť vzdialený od krycieho sklíčka, takže tam netreba meniť lom svetla olejom. Ak je však kombinácia okulár 10x a objektív 100x, tam už olej treba použiť. 100-ky sa už takmer dotýkajú krycieho sklíčka (preparátu), preto tam musí byť iný lom svetla. Zatiaľ som nepočul o 100-ke objektíve, kde by sa nedával olej. Ja mám objektívy 4x, 10x, 40x a 100x a okuláre 10x, 16x a 10x so stupnicou. Posledné dva spomenuté okuláre som si dokúpil. Môj mikroskop je monokulár s označením SM3 - študentský mikroskop a kúpil som ho vo firme Kvant na Mat.-Fyz. fakulte. K mikroskopu bola priložená plastová nádobka s imerzným olejom, ktorý mi vystačil asi na 1 rok. Teraz používam parafínový olej a mám s ním dobré skúsenosti. Na sledovanie tvaru výtrusov, vreciek a stavby pletiva stačí aj 40-ka objektív v kombinácii s 10-kou okulárom, čo je vlastne bez oleja, no určenie druhu je obtiažnejšie, keďže pri menšom zväčšení a prípadnom meraní môžeme pri menších objektoch - výtrusoch dostať po prepočítaní skreslené hodnoty. Pri takomto zväčšení sa zvyknú merať väčšie elementy, napr. chlpy, cystidy, ktoré sa pri 1000-násobnom zväčšení nezmestia do zorného poľa. Aby okulárový mikrometer správne plnil svoj účel, musí byť najskôr porovnaný s objektívovým mikrometrom, ktorý vyzerá ako podložné sklíčko, len má v strede stupnicu. Toto ciachovanie ochotne robievali v Kvante (neviem, či to tam niekto ešte robí). Výsledná odchýlka sa potom násobí so zistenými hodnotami pri meraní. U mňa jeden dielik predstavuje 0,991 mikrometra, čo vlastne do dĺžky (výtrusu) 20 mikrometrov nemá veľký zmysel prepočítavať, lebo je to veľmi malá odchýlka. Takúto miernu odchýlku (alebo minimálnu, žiadnu) majú väčšinou mikrometre kompatibilné s príslušným mikroskopom. U niektorých mikroskopov je táto odchýlka dosť výrazná.

Ako huby krájať?

Čiaškovité huby, prilbičky, peniazovky, hviezdovky - vcelku, huby väčších rozmerov, ako sú hríby, práchnovce a veľké čírovky môžeme rozpoliť, prípadne nakrájať na plátky (stačí 3-5 plátkov). Musíme dbať na to, aby tam boli všetky dôležité znaky, vrátane bázy hlúbika, teda do herbára nie sú vhodné huby, ktoré majú urezaný hlúbik. Takýmto spôsobom nakrájané a usušené huby už len vkladáme do papierových obálok, ktoré poskladáme napr. z kancelárskeho papiera formátu A4 a na vrchnú stranu nalepíme alebo písacím strojom naklepeme názov druhu, štát, geomorfologický celok, obec, názov lokality, typ lokality, lesa, substrátu, nadmorskú výšku, dátum, meno zberateľa a určovateľa. Návody na herbár sa dajú nájsť aj v niektorých atlasoch, najlepšie je to vysvetlené v Dermek/Lizoň - Malý atlas húb.

Čo sa týka mikroskopovania, základom je mikroskop zväčšujúci aspoň 1000x, aby sme videli prípadnú ornamentiku na bunkovej stene výtrusov. Dôležitou súčasťou, ak chceme rozlišovať mikroskopicky veľmi podobné druhy húb, je merací okulár. Na zvýraznenie ornamentiky existujú mnohé chemikálie, najčastejšie sa používa Melzerovo činidlo (slúži hlavne na zisťovanie amyloidity výtrusov - teda či sa jeho vplyvom sfarbujú na modro alebo nie), potom je to kongočerveň, bavlníková modrá a iné, pričom každé farbivo sfarbuje iné štruktúry (cytoplazma, bunková stena).

Namiesto farbív však môžeme použiť čistú vodu, ak nemáme v úmysle pozorovať zvýraznené pletivá, ornamentiku, ale napríklad len farbu výtrusov, ktorá by vplyvom farbiva mohla byť zmenená. Chemikálie sú len takým doplnkom k mikroskopovaniu, lebo často vo vodnom preparáte nevieme niektoré štruktúry rozlíšiť.

Výtrusy je najlepšie mikroskopovať z výtrusného prachu, lebo vtedy sú v podstate zrelé. Dajú sa pozorovať aj na lupeňoch, čo je spôsob, ktorý sa používa hlavne pri sušených herbárových položkách, kde už sa nedá tento prach získať. Pokiaľ ale nejdeme merať výtrusy a zisťovať napr. priemernú dĺžku a šírku, úplne stačí keď ich sledujeme na lupeni, ktorý dáme na mikroskopické sklíčko.

Ako sa mikroskopuje?

Najbežnejší spôsob, ako mikroskopovať hubu, je narezať tú časť pletiva, ktorú chceme mikroskopovať, žiletkou na čo najtenšie, doslova mikroskopicky tenké plátky, pretože pri svetelných mikroskopoch je dôležité to, aby svetlo preniklo cez pozorované pletivo. Naše nádherné plátky (vyberáme tie najkrajšie) vložíme do pripravenej kvapky vody a prikryjeme krycím sklíčkom (teda ak sa nám ho predtým nepodarí zlomiť medzi prstami). A preparát je na svete. Tak isto to robíme aj s farbivom, ktoré buď dáme namiesto kvapky vody, alebo ho pridáme technikou presávania (z jednej strany sklíčka máme pijavý papier, z druhej pridáme farbivo, voda, ktorú sme tam mali predtým, sa odsaje).

Ako robíme preparáty z jednotlivých štruktúr?

U askomycétov - vreckatých húb, ak chceme sledovať celú plodnicu, narežeme tenké plátky tak, aby napr. u ohnivca ten približne 0,1-0,3 mm plátok pozostával z plodnej, červenej časti a z druhej strany chĺpkov na spodnej časti. Červená farba v preparáte je spôsobená červenými pigmentami v tenkých kyjakovitých bunkách - parafýzach, ktoré obklopujú pre nás veľmi dôležitú časť, ktorou sú bezfarebné vrecká s výtrusmi. Sú to také podlhovasté tuby, väčšinou po osem výtrusov (ohnivce, čiašky, jahňadky...), menej často so štyrmi, dvoma (smrčkovec český - lebo ich má veľké), ale sú aj rody, ktoré majú vo vrecku tisícky výtrusov. Mnohí si môžu klásť otázku, prečo je ohnivec črvený, keď vrecká sú bezfarebné. Je to spôsobené práve sterilnými bunkami s pigmentom - parafýzami, ktoré môžu mať konce umiestnené nad vreckami, preto ich celé zakrývajú a pigment je o to výraznejší aj makroskopicky.

Čo sa týka výtrusov, tie nemajú nikdy stopku, pretože sa neoddeľujú z bazídií, u niektorých druhoch sa na nich však môžu vyskytnúť určité výrastky. Ornamentika je veľmi bohatá a preto sú výtrusy askomycétov jedny z najkrajších. Veľa druhov má hladké výtrusy (napr. smrčky). Pestro ornamentované (ostne, bradavice, sieťka) majú mnohé druhy čiašok, veľmi pekné výtrusy, hlavne pozafarbení, má tanierovka oranžová.

To by bolo k plodnej vrstve vreckatých húb. pod vreckami sa nachádza pletivo s bunkami rôzneho tvaru, pri čiaške zvrsvenej (P. varia) sa nachádza až 5 vrstiev rôzneho vzhľadu. Pri ohnivcoch sú na vonkajšej strane chĺpky, ktoré majú pod mikroskopom rôzny tvar, na základe čoho sa dá zistiť druh. Ohnivec rakúsky ich má zakrútené, o. šarlátový rovné. Existujú však aj iné typy plodníc vreckatých húb ako čiaškovité. Smrčky majú výtrusorodú vrstvu v jamkách na klobúku, plodnice drevnatcov sú však tiež vreckaté huby, ich plodnice však nie sú tie kyjaky, ktoré rastú na dreve, ale drobné čierne zrnká, ktoré pokrývajú povrch toho kyjaka - nosiča. Sú guľovitého tvaru a vnútri možno nájsť vrecká s výtrusmi, u drevnatcovitých húb (patrí tam aj drevovček) sú výtrusy tmavo sfarbené, na rozdiel od čiaškovitých húb, kde prevažujú bezfarebné výtrusy. Takže aby som to zhrnul, najprv treba určiť o aký typ plodnice ide (čiaškovitá, drevnatcovitá), kde sú lokalizované vrecká s vútrusmi. Ak to vieme, pripravíme si z tejto časti čo najtenší preparát. U čiaškovitých húb sledujeme vrecká s výtrusmi (veľkosť, tvar, prípadnú ornamentiku), tvar parafýz, ich prípadné rozdvojovanie pri báze, segmentáciu, štruktúru pletiva pod vreckami, tvar buniek a u niektorých druhov chĺpky na vonkajšej strane.

U bazídiových húb je toho na pozorovanie viac. Tam sledujeme výtrusy, ktoré vyrastajú nie vo vreckách, ale na prevažne kyjakovitých bazídiách, ktoré sú väčšinou štvorvýtrusné (ale aj dvojvýtrusné, či iný počet). Bazídiá s výtrusmi nájdeme na povrchu plodnej časti huby. Pri najbežnejších objektoch nášho záujmu - klobúkatých plodniciach, tieto bazídiá nájdeme na celom povrchu lupeňov, ostňov, žiliek a pri hríbovitých hubách na vnútornej ploche rúrok. Bazídiá s výtrusmi vyrastajú tesne vedľa seba a medzi nimi sa nachádzajú sterilné bazidioly, ktoré majú približne rovnaký tvar, ale sú bez stopiek (sterigiem), teda aj bez výtrusoch, ktoré na tých sterigmách vyrastajú. Medzi bazídiami a bazidiolami sa pri mnohých druhoch nachádzajú aj cystidy, ktoré sú nápadné úplne rozdielnym tvarom oproti kyjakovitým bazídiám a bazidiolám. Sú významným rozlišovacím znakom, práve pre ich tvar a to, či sa tam nachádzajú, alebo nie. Tieto cystidy delíme na tzv. cheilocystidy - cystidy na ostrí lupeňa a pleurocystidy - cystidy na ploche lupeňa, teda všade okolo, len nie na ostrí. Tieto dva typy sú buď tvarovo totožné, alebo sa úplne líšia, čo je tiež významným rozlišovacím znakom. To sú základné štruktúry, hyménia, teda výtrusorodej vrstvy klobúkatých (lupenatých, ostnatých, rúrkovitých) húb. Podobne je to aj u pevníkov, práchnovcov, atď, len treba vedieť, kde je tá výtrusorodá vrstva. Preparát u lupenatej huby sa pripraví tak, že položíme lupeň na slíčko a nakrájame ho na plátky. Tieto plátky na sklíčku otočíme o 90 stupňov. Je to vhodné na sledovanie bazídií, bazidiol, výtrusov a pleurocystíd. Ak chceme sledovať cheilocystidy, urežeme časť ostria lupeňa a hotovo. Potom už len pridáme vodu alebo farbivo a pozorujeme. No nielen lupene sledujeme na klobúkatých plodniciach. Často nájdeme dôležité rozlišovacie znaky aj na povrchu klobúka či hlúbika. Na klobúku môžeme nájsť "klobúkové cystidy" - pileocystidy, na hlúbiku kaulocystidy. Veľmi vhodnou hubou na ich pozorovanie je hnojník rozosiaty (Coprinus disseminatus), ktorý ich má veľmi hojné, pretože patrí práve do skupiny hnojníkov, ktoré sú charakteristické prítomnosťou týchto znakov, na základe ktorých ho môžeme do tejto podsekcie zaradiť. Ak má huba na klobúku plachtičku (velum), sledujeme tvar a veľkosť buniek. Z klobúka i hlúbika môžeme žiletkou buď odlúpnuť časť pokožky, prípadne, čo sa používa menej často, zhotoviť plátok z okraja dovnútra dužiny.

Melzer by sa hodil na veľa vecí, napríklad na zisťovanie amyloidity výtrusov, teda tie výtrusy, ktorých stena sa s jeho použitím sfarbí na modro, sú amyloidné, tie ktoré nie, sú neamyloidné. Pri niektorých rodoch je to významný identifikačný znak. Je to podobné ako pri Lugolovom roztoku, ktorým sa zisťuje škrob v rastlinách. Huby škrob neobsahujú, ale na znak podobnosti týchto reakcií je tam ten slovný základ amylo- (škrob-). Amyloidná je napríklad ornamentika výtrusov u plávok a rýdzikov, preto sa s použitím tohto roztoku zvýraznia bradavice a rebrá na ich povrchu. Bez jeho použitia je veľmi obtiažne tieto štruktúry pozorovať. Aj pri strapačkovitých hubách je Melzer vhodný, lebo lepšie zvýrazňuje štruktúry pletív ako iné farbivá. Ja okrem Melzerovho činidla používam tiež kongočerveň, COTTON blue - bavlníkovú modrú a bázický fuchsín. Každé z týchto činidiel má svoje špecifické vlastnosti pri farbení. Niektoré zvýrazňuje lepšie cytoplazmu, iné bunkovú stenu (obrysy štruktúr) a aj pri rôznych hubách sú tieto vlastnosti iné. Treba skúšať, čo kam lepšie pasuje. Ja napríklad na hnojníky používam kongočerveň.

Sulfovanilín alebo FeSO4 sa bežne používajú na farebné zmeny dužiny napríklad u plávok

Rady od: Ing. Dalibor Matýsek

Pro velké zvětšení s obj. 100x je potřebné připravit kvalitní preparáty. Bývá problém s tím, aby výtrusy v preparátě byly jenom v jedné vrstvě a aby se nepohybovaly. A ony se výtrusy pohybují, plavou velmi často. Způsobuje to na fotkách kromě všech možných optických vad i pohybovou neostrost. Voda jako medium se mi naprosto neosvědčila. Používám buď řídší glycerinželatinu nebo husté detergenty. Osvědčil se mi např. zelený - březový šampon na vlasy.

K tomu aby výtrusy byly v jedné vrstvě je dobré je nechat samovolně napadat na podložní sklíčko. Je to stejné jako u sledování barvy výtrusného prachu. Plodnici bez třeně položit na krycí sklíčko, přiklopit sklenicí a nechat nejlépe přes noc přikrytou. Pak, pokud je tam příliš hrubá vrstva, tak žiletkou seškrábnout a trošku přenést na druhé sklíčko do kapky vody. pak tu kapku rozmíchat, rozetřít a nechat uschnout.

Rady od: Paľo °

Mikroskopovanie:

predovšetkým na rezy je potrebná ostrá žiletka. Ja ich mením po prerezaní cca 20 rezov, alebo keď cítim, že už nereže podľa mojich predstáv. Pri mikroskopovaní exikátov treba študovanú časť navlnčiť, nie aby z toho tiekla voda, napr. položiť na namočený toaletný papier a nechať cca 10 minút vlhčiť. Keď cítiš, že sa napr. lupene nelámu, ale sú pružné je to ok. Nie všetky druhy lupenatých alebo iných húb majú cystidy, ak majú postupuj takto. Najprv treba zistiť, či má cheilocystidy-to sú cystidy na ostrí lupeňov. odrežeš kus lupeňa aby si zachoval celistvé ostrie a pamatať si ktorou stranou si si ho položil na sklíčko, lebo obraz v okulári je obrátený. Preparát nesmieš roztlačiť, pretože štruktúry sa rozpadnú a nebudeš vidieť ostrie lupeňa. Pleurocystidy-cystidy na ploche lupeňov, sa často pozerajú ťažšie. Aby si vylúčil možné cheilocystidy na ostrí treba ostrie lupeňa odrezať (po získaní cviku to už robiť nemusíš)a potom to najťažšie - urobiť priečny rez lupeňom, urobiť viac rezov lebo málokedy je jeden rez dostačujúci a opať preparát neroztlačiť, aby si videl trčiace cystidy z lupeňa. Urobiť priečny rez lupeňom je veľmi ťažké a ešte ťažšie je položiť odrezanec rezom na sklíčko. Ak sa Ti to nepodarí urob aspoň čím tenší priečny rez , z neho vačšinou uvidíš pleurocystidy, aj keď sa Ti nepodarí položiť preparát rezom na sklo. Neviem či vieš, čo sú to cystidy, sú to sterilné bunky v hyméniu lupeňa, ktoré sú vačšie oko ostatné bunky hyménia, preto trčia do priestoru. Cystidy u niektorých rodov sú aj na iných častiach plodnice. Caulocystidy sú na pokožke hlúbika, pileocystidy na pokožke klobúka.

zistovanie dospelosti vytrusov u ascomycetov
1. Za dospelé sa považujú výtrusy, ktoré sú vystrelené z vrecka, teda voľne plávajú okolo preparátu. aj pri vreckatých hubách sa dajú získať uvoľnené výtrusy - na výtrusorodú plochu - técium sa položí krycie sklíčko a čakáš. Hubu treba držať vo vlhkom prostredí. Ak je huba dostatočne dospelá vystrelí výtrusy.
2. Ak pri zafarbení preparátu bavlníkovou modrou v kyseline mliečnej -činidlo- sa vnútro výtrusov zafarbí na modro výtrusy sú nedospelé. Dospelý výtrus ostáva vo vnútri nezafarbený. Farbí sa len stena výtrusu a ornamentika ak je prítomná.

ake su sposoby pripojenia vrecka a tvar parafyz na konci
Vrecko na báze sa pripája buď jednoduchým pripojením na hýfu, alebo dvomi plôškami tesne vedľa seba - tzv. fibulárne pripojenie. Tento druhý prípad má ešte zvýraznenú polohu, že na báze vrecka trčia dve predĺženia dlhé niekolko mikrometrov a až tie sa pripájajú na askogénne hýfy. Zahnuté parafýzy môžu byť len nepatrne v na konci v tupom uhle alebo tvoria hore oblúčik

co je potrebne na mikroskopovanie chorosov
1.Dostatočné množstvo kvalitnej odbornej literatúri- v mojej knižnici,čítajúcej cca 500 titulov je asi 60 odborných kníh zaoberajúcich sa výhradne chorošmi teda Polyporaceae sl.
2.Kvalitný mikroskop zväčšujúci min 1000x + činidlá napr.:Melzerovo činidlo,kongo červeň,KOH atď.
3.Stereoskopický mikroskop(lupa)zväčšujúci min. 25x, pretože len pri takomto zväšení sa dajú z tvrdých chorošov robiť žiletkou mikroskopické rezy
4.Veľkú trpezlivosť,pretože trvá dlho než sa to človek naučí ak ho neodradia počiatočné neúspechy a nejde radšej mikroskopovať mäkké huby,ktoré si lahko roztlačí pod mikroskopom.

k mikroskopovaniu
1. Cim mensie zvacsenie objektivu, tym vacsi priestor medzi objektivom a preparatom a tym viac svetla tadial prenika. Kedze 100-vka objektiv je uplne skoro az nalepeny pri sklicku, musi to byt vyriesene inym lomom svetla, na co sluzi imerzny olej. Spravis preparat, prikryjes krycim sklickom, na to kvapnes kvapku oleja (staci taka 3-4 mm) a normalne ponoris do toho ten objektiv, nic sa mu nestane, len ho potom v zavere mikroskopovania utri nejakou jemnou servitkou. Pouzivaj len na 100-vke. Uvidis, ze obraz bude ovela jasnejsi ako bez oleja.
2. Mikrometer treba naciachovat, lebo nie vzdy to sedi na 100%. U mna jeden dielik predstavuje 0,991 mikrometra, takze ked vidim, ze ma vytrus 10 mikrometrov, tak ma vlastne len 9,91, co je taka slaba odchylka, ze to ani neprepocitavam, lebo viac sa moze mylit zrak. Niekedy je vsak odchylka ovela vacsia a musi sa prepocitavat. Malo by to vsak sediet, pokial ide o kompatibilny meraci okular. Obvykle prepocitavaju ti, co si napr. na staru Meoptu kupia novy, nekompatibilny okular. Prepocet sa da urobit tak, ze namiesto sklicka das pod mikroskop specialny objektivovy mikrometer, co je vlastne ako podlozne sklicko s mikrometrickymi dielikmi a pozeras cez mikrometricky okular. Spravne by sa ti to malo prekryvat, ak nie, musis zistit, do akej miery je jedna mierka kratsia ako druha a nejako to logicky prepocitat.
3. Mozes pouzivat aj normalnu vodu, spomalit vytrusy sa da len tak, ze preparat trochu uschcne, ale je dost tazke ich zastavit. Je to umenie.
4. Najlepšie je urobiť si priemer veľkostí výtrusov. Ak vezmeš najextrémnejšie veľkosti, ktoré nájdeš v preparáte a nejaké priemerné výtrusy, stačí aj 10 meraní. Obvykle sa však vo vede meria 30 výtrusov, čo je síce časovo náročnejšie, ale aj presnejšie. Môžeš vypočítať aj Q, čo sa uvádza v niektorých kľúčoch, čo je aritmetický priemer tridsíatich meraní. Teda dĺžka/šírka ... vydelíš pre každé meranie, dostaneš pod seba 30 hodnôt, napr. 1,25; 1,37... a tieto spočítaš a to celé vydelíš tridsiatimi, resp. počtom meraní. Vyjde Ti priemerná hodnota Q, čo sa dá využiť pri porovnávaní viacerých položiek. Toto isté sa robí napríklad aj s cystidami a inými mikroznakmi a sleduje sa, či má veľkosť výtrusov alebo iných znakov súvis napr. s makroznakmi, čo môže viesť k opísaniu nového druhu, napr. nejakej veľkovýtrusnej formy huby, ktorá makroskopicky vyzerá rovnako.

Zdroj: Miloslav Procházka, Ján Červenka, Ing. Dalibor Matýsek, Paľo°
Autor článku: Stano Husár (Husi)